NeoProof-DNA-Polymerase
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Beschreibung
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Produktkomponenten und Lagerung
- Geliefert mit 10× Reaktionspuffer und 5× Stabilisatorlösung
- Empfohlene Lagerung bei -20 °C in einem Gefrierschrank mit konstanter Temperatur
- Stabilität bis zum Verfallsdatum bei vorschriftsmäßiger Lagerung
- Definition der Einheit: Einbau von 10 nmol dNTPs in 30 Minuten bei 72 °C
PCR-Protokoll
- Standardprotokoll als allgemeiner Leitfaden für die PCR-Amplifikation
- Richtlinien für den Reaktionsaufbau, einschließlich der Reihenfolge der Komponenten und des Aufbaus auf Eis
- Zyklusparameter für Denaturierung, Annealing und Extension
- Gelelektrophorese zur Analyse der PCR-Produkte
Überlegungen zum PCR-Design
- Entwurf von PCR-Primern mit geeigneter Länge (15-30 Basen)
- Empfehlungen für Primer-Sequenzen zur Verbesserung der PCR-Ausbeute und zur Vermeidung von Degradation
- Richtlinien für den GC-Gehalt von Primern und die Vermeidung interner Sekundärstrukturen
- Empfehlungen zur Vermeidung von Primer-Dimer-Bildung und unspezifischem Primer-Annealing
- Bedeutung von ähnlichen Schmelztemperaturen (Tm) für beide Primer
DNA-Vorlage
- Empfohlene Mengen an Ausgangsmaterial je nach Qualität und Komplexität
- Richtlinien für die Verwendung von genomischen DNA-Vorlagen und cDNA-Synthesereaktionsvorlagen
- Vorsicht vor der Überschreitung von 10 % des endgültigen PCR-Reaktionsvolumens für cDNA-Templates
Enzym-Konzentration
- Empfohlene Enzymkonzentration von 1,25 U (0,5 μL) in einer 50 μL-Reaktion
- Höhere Enzymvolumina (bis zu 2,5 U) für die Amplifikation reichhaltiger Vorlagen (>50 ng gDNA)
- Verdünnungsoptionen zur Vereinfachung des PCR-Aufbaus
Qualitätskontrolle Assays
- Bewertung der Reinheit durch SDS-PAGE und Coomassie-Blau-Färbung
- Bewertung der genomischen DNA-Kontamination durch PCR
- Nuklease-Assays zur Überprüfung auf das Einklemmen oder Schneiden von Nukleinsäuren
- Funktionstest mit DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe aus menschlicher genomischer DNA