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Western-Blot-Protokoll

Western-Blot-Protokoll

 

Benötigte Produkte:
Vorbereitung von Proteinen und Trennung durch Gelelektrophorese
  1. Entnahme einer kleinen Menge der Proteinprobe zur Bestimmung der Proteinkonzentration
  2. Nehmen Sie 20 µg Proteine und fügen Sie Laemmli
  3. 5 Minuten bei 95°C kochen, dann die Röhrchen drehen
  4. Gleiches Volumen an Proteinen in die Vertiefungen des SDS-PAGE-Gels einfüllen (Acrylamid-% hängen von der Größe des Zielproteins ab), eine Vertiefung für die Kontrollgewichtsleiter nicht vergessen.
  5. Migration bei konstanter Stromstärke mit entsprechendem Puffer

Proteintransfer vom Gel zur Membran
  1. Legen Sie das Sandwich (Gel/Membran/Flottenpapier) in die Transferbox und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen eingeschlossen sind.
  2. Übertragung bei konstanter Spannung mit dem entsprechenden Puffer


Antikörper-Inkubation und -Offenbarung
  1. Färben Sie die Membran mit Ponceau-Rot an, um die Qualität des Proteintransfers zu überprüfen.
  2. Die Membran abreißen und in Blocking-Lösung inkubieren
  3. Mit dem primären Antikörper über Nacht bei 4°C inkubieren
  4. Rince der Klecks
  5. Mit dem sekundären Antikörper 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren
  6. Die Membran zerreißen
  7. Auftragen des Substrats auf den Blot